免疫印迹法或称“蛋白质转渍法”、“Western印迹法”，是在分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。

       利用特定抗体能够专一结合其抗原蛋白质的原理来对样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息，来分析检测特定蛋白质的生物学检测技术。

       本文通过以下几点详细阐述免疫印迹实验的原理步骤及应用范围：

       1.原理

       2.实验步骤

       3.分类

       4.医学诊断应用

原理

       免疫印迹法与Southern或Northern杂交方法类似，但免疫印迹法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（根据分子大小）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验步骤

       实验大致分为电泳、转膜、抗体孵育及显影分析几个部分。

       电泳分离蛋白质：由裂解细胞或组织制备目的蛋白质样品，经SDS-PAGE电泳处理后，不同分子质量大小的蛋白质得到分离。

       转膜：将电泳分离的条带从凝胶转移至NC/PVDF膜上。常用的方法是电洗脱或电泳转移，形成“负极-海绵-三层滤纸-胶-膜-三层滤纸-海绵-正极”转膜结构，在施加电场后蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶中移出并吸附在膜表面。

       抗体孵育：用目标蛋白的抗体（一抗）处理膜，漂洗除去未结合的抗体，膜上仅含有目标蛋白结合的一抗。再用标记的二抗进行酶免疫定位。

       显影分析：用x-ray底片曝光，根据信号的强弱调整曝光时间或不同时间多次压片以达到最佳效果。曝光完成后取出x-光片迅速浸入显影液中显影，待条带明显后停止显影，分析结果。

免疫印迹操作步骤流程图

分类

免疫印迹显色的方法主要有以下几种：

1.放射自显影

2.底物化学发光ECL

3.底物荧光ECF

4.底物DAB呈色

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

医学诊断应用

1.确证HIV检测采用Western印迹法以检测在人血清样品中的抗-HIV抗体

2.Western印迹法还用作决定性测试牛海绵状脑病

3.某些形式的莱姆病检测用Western印迹法

4.Western印迹法也可以被用来作为乙型肝炎病毒感染的确定测试

5.在兽医中，Western印迹法有时被用于确认猫的猫免疫缺陷病毒FIV+状态

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